Методы ИФА и ПЦР
ПЦР: СВЕРХЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ
ПЦР — ЭТО МЕТОД ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ, НАПРАВЛЕННЫЙ НА ВЫЯВЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ТРЕХБУКВЕННЫЙ ВАРИАНТ — ЭТО АББРЕВИАТУРА НАЗВАНИЯ «ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ». СОБСТВЕННО, В ЭТОМ НАЗВАНИИ И ОТРАЖАЕТСЯ СУТЬ МЕТОДА

Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.
За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе. У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причем для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и ее фрагменты можно находить с помощью ПЦР. Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий. Один цикл ПЦР длится около трех минут, количество копий растет в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз.
ДОСТОИНСТВА
Понятно, что теперь
определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно
легко. Какую же практическую выгоду получает человек, когда отправляется
на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР?
— Безусловно, одно из главных достоинств
— это универсальность метода. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и
РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для
ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы
ищем.
— Следующий плюс — высокая специфичность. В материале,
направленном на исследование, определяется уникальная последовательность
нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким
образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме
того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить
поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества
ответа.
— Метод ПЦР обладает высочайшей чувствительностью – мы уже
говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического
материала возбудителя.
— Несомненное преимущество метода –
оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким
образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до
получения результата, отнимет всего один день.
— При помощи ПЦР
определяют возбудителя, а не реакцию на его внедрение со стороны
организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать
заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических
или лабораторных признаков болезни. Когда нужно делать?
Когда следует бежать в лабораторию, чтобы проанализировать итоги вашего летнего отпуска?
Специалисты
советуют делать это в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения
в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов,
дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений (цвет,
количество, консистенция), случайный половой контакт без применения
презерватива. Безусловно, ПЦР — мощный и эффективный диагностический
инструмент, позволяющий быстро и точно найти возбудителей очень многих
инфекций. Чаще всего его используют для диагностики именно заболеваний,
передающихся половым путем.
В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР? необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными серологическими методами, например — ИФА.
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ИФА)
В основе иммуноферментного анализа (ИФА) лежит иммунная реакция антигена с антителом.
Для исследования методом ИФА используется кровь из вены, полученная натощак.
Иммуно-ферментный
анализ (ИФА) применяется в диагностике урогенитальных инфекций для
выявления наличия в сыворотке крови специфических иммуноглобулинов (Ig
или антител) — белков, вырабатываемых клетками иммунной системы,
направленных на борьбу с внедрившимся в организм инфекционным агентом.
Связываясь с микробной клеткой или продуктами ее жизнедеятельности,
иммуноглобулины нейтрализуют их и способствуют их элиминации. Таким
образом, иммуноглобулины представляют собой суть гуморального
иммунитета, то есть иммунитета, обусловленного субстанциями,
содержащимися в жидкостях тела, в отличие от клеточного иммунитета,
связанного с присутствием специальных клеток иммунной системы.
На
каждый вид (и даже подвид) возбудителя вырабатываются свои определенные
антитела, которые, как правило, не связываются ни с каким другим
инфекционным агентом. Благодаря этому определение антител обеспечивает
достаточно высокую специфичность анализа. Из пяти классов Ig в
диагностике инфекционных заболеваний чаще всего используются Ig трех
типов А, M и G. Прежде всего нужно помнить, что существует некоторый
промежуток времени с момента внедрения инфекционного агента в организм и
до момента появления антител в сыворотке крови — это так называемый
серонегативный период. Для различных инфекций и отдельных индивидуумов
он может быть неодинаков, в среднем же для возбудителей урогенитальных
заболеваний он составляет 1-4 недели.
РАСХОЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИФА И ПЦР
Случается, что результаты ПЦР и ИФА-диагностики могут не совпадать. Обычно это происходит вследствие нескольких причин:
—
«Иммунологический след» — «след» от уже перенесенной инфекции. В ответ
на внедрение инфекции организм начинает вырабатывать антитела, в
частности, антитела класса IgG. Эти антитела «улавливает» ИФА-анализ.
Метод ПЦР реагирует только на наличие молекул ДНК инфекции в организме. В
такой ситуации ПЦР-анализ дает отрицательный результат, а ИФА —
положительный. При чем в связи с индивидуальными особенностями иммунной
системы положительный результат ИФА-диагностики, вызванный повышенным
содержанием антител, может сохраняться несколько месяцев и даже лет
после полного выздоровления.
— Разница в оборудовании для проведения
диагностики. Получение положительного результата ИФА и ПЦР —
отрицательного, может быть вызвано использованием особых тест-систем в
ИФА-анализе, которые выявляют все виды бактерий, в том числе те, которые
в определенном количеств в норме содержатся в организме человека.
Тест-система, используемая в ПЦР-анализе, может быть основана только на
определении особого вида болезнетворных бактерий. Например, тест-система
для ИФА-диагностики настроена на выявление всех видов хламидий : С.
Pneumonia, C. Pecorum, C. Psittaci, а в проведении ПЦР-анализа может
быть использована тест-система, выявляющая только С. Trachomatis. Вот
почему ИФА-анализ на С. Pneumonia будет положительным, а ПЦР —
отрицательным.
— Разница в используемом материале.
Материал для
ПЦР получают из места предполагаемой локализации инфекции. Для
ИФА-диагностики разницы в месте нет, поскольку ИФА «реагирует» на
антитела, которые вырабатываются при инфекционном процессе любой
локализации. Как результат — ПЦР-диагностика дает отрицательный, а ИФА —
положительный результат. Например, хламидии могут локализироваться в
разных местах организма. Вызвав хронический сальпингит, проведенный в
области шейки матки анализ ПЦР хламидии не обнаружит. Но ИФА-диагностика
все равно выявит выработку антител, сопровождающую инфекционный
процесс.
— Хронические инфекционные заболевания могут стать причиной
разницы в результатах ИФА и ПЦР-диагностики. При этом зачастую ПЦР дает
положительный, а ИФА — отрицательный результат. Уставшая от
хронического инфекционного процесса иммунная система может «не показать»
повышенный уровень антител к инфекции. Подобное может наблюдать
врач-лаборант в том случае, если инфекция «свежая», т. е. даже при
наличии определенных симптомов уровень антител класса IgG в крови не
превысит норму, поскольку они еще не начали вырабатываться. Для половых
инфекций подобный период «молчания» ИФА-диагностики может достигать двух
недель.